Inhibiteurs de la protéine NS5A du virus de l’hépatite C : une seule cible pour deux actions antivirales

L’équipe de François-Loïc Cosset au Centre international de recherche en infectiologie, a élucidé un des modes d’action du Daclatasvir, un inhibiteur de la protéine NS5A requise pour la réplication du génome viral et l’assemblage du virus VHC. Cette étude qui ouvre la voie au développement d’inhibiteurs de nouvelle génération, a été publiée le 5 décembre 2016 dans la revue Gastroenterology.

Environ 180 millions de personnes sont infectées par le virus de l’hépatite C (VHC) à travers le monde. L’infection chronique engendre des perturbations hépatiques qui peuvent évoluer en cirrhose ou en hépato-carcinome. La compréhension moléculaire détaillée de certaines étapes clefs du cycle viral a permis le développement d’antiviraux à action directe à un rythme très soutenu depuis le début des années 2010, autorisant pour la première fois un réel espoir de guérison pour les personnes infectées. Ces inhibiteurs extrêmement efficaces ciblent spécifiquement 3 protéines virales agissant à des étapes différentes du cycle infectieux. On distingue les inhibiteurs de la protéase NS3/4A qui interfèrent avec le clivage de la polyprotéine virale, les inhibiteurs de la polymérase NS5B qui bloquent la réplication du génome viral, et les inhibiteurs de la phospho-protéine NS5A qui impactent la réplication et l’assemblage du virus. Si les mécanismes d’action des deux premières classes d’inhibiteurs sont relativement bien connus, celui des inhibiteurs de NS5A reste mal défini.
En utilisant des techniques d’imagerie pointues, l’équipe « Virus Enveloppés, Vecteurs et Immunothérapie », de François-Loïc Cosset a permis de conforter le rôle d’un inhibiteur de la protéine NS5A dans l’assemblage du VHC et de caractériser son mode d’action. Les chercheurs ont montré que le Daclatasvir (DCV), utilisé en clinique, induit très rapidement une agrégation de NS5A (protéine non-structurale impliquée dans la formation des structures de réplication et dans l’assemblage viral), mais également l’agrégation des protéines structurales core (protéine de capside) et E2 (glycoprotéine d’enveloppe) ainsi que de la protéine non-structurale NS4B (protéine impliquée dans la formation des structures de réplication) au sein de mêmes sites intracellulaires. Ces travaux ont également permis de mettre en évidence l’existence de telles structures au cours de l’établissement de l’infection, en absence de DCV, indiquant que les sites de réplication et d’assemblage du virus sont intimement associés et que l’inhibition de l’assemblage induit leur agrégation en concentrant les protéines non mobilisées pour la production de particules virales. Plus spécifiquement, ces travaux ont enfin démontré que le DCV bloque le transfert du génome viral (un ARN simple brin positif), lequel est effectué par la protéine NS5A depuis les sites de réplication jusqu’aux sites d’assemblage des particules virales.
Ce mécanisme d’inhibition de l’assemblage viral s’ajoute donc à celui précédemment mis en évidence de l’inhibition de la réplication du génome. Ainsi, le DCV, en ciblant une seule protéine, NS5A, agit de concert sur l’inhibition de deux étapes clefs du cycle viral. Quelques heures seulement après l’initiation du traitement, le DCV bloque le transfert du génome viral vers les sites d’assemblage, stoppant ainsi très rapidement la production de nouvelles particules virales. Parallèlement, la drogue bloque la formation de nouvelles structures de réplication, en continuel renouvellement, agissant donc plus tardivement sur la production de nouvelles molécules d’ARN viral.
La compréhension du mécanisme d’action à deux niveaux de cette classe d’inhibiteurs de la protéine NS5A pourrait ainsi expliquer l’extrême efficacité de ces molécules sur les cellules infectées et devrait faciliter le développement d’inhibiteurs de prochaine génération pour contrer les mutations de résistances qui apparaissent chez certains patients.




Figure : Modèle de l’agrégation des protéines virales induite par le Daclatasvir (DCV). En absence de DCV, les vésicules à double membrane (DMVs) répliquent le génome viral qui va permettre en premier lieu la traduction de la polyprotéine virale. Les protéines structurales core, E1 et E2 s’accumulent pour former les sites d’assemblage, et les protéines non structurales s’accumulent en formant de nouvelles DMVs, NS5A jouant un rôle clef dans cette biogénèse. Parallèlement, le génome viral va être encapsidé dans les particules virales en formation suite à son transfert qui dépend de NS5A et probablement de sa localisation à la surface des gouttelettes lipidiques (LDs), lesquelles jouent un rôle critique dans l’assemblage viral. Les particules virales sont ensuite enveloppées, maturées et sécrétées via la voie de sécrétion. De nouvelles DMVs sont également individualisées de leur site de biogénèse et remplacent les anciennes DMVs qui deviennent rapidement inactives. Le système est ainsi plus ou moins à l’équilibre et revient à la situation initiale. Cependant, en présence de DCV, la perturbation des propriétés membranotropiques de NS5A pourrait empêcher son positionnement correct sur les membranes du réticulum endoplasmique ou des LDs, empêchant ainsi la formation de nouvelles DMVs et des particules virales. En conséquence, le DCV induit une accumulation des protéines virales aux sites de biogénèse des DMVs et d’assemblage des particules virales. Finalement, le système s’interrompt car il n’y a plus de DMVs pour répliquer le génome viral, ceci expliquant l’effet retardé du DCV sur la réplication.
© Bertrand Boson et François-Loïc Cosset

 

En savoir plus
* Daclatasvir Prevents Hepatitis C Virus by Blocking Transfer of Viral Genome to Assembly Sites 
Bertrand Boson, Solène Denolly, Fanny Turlure, Christophe Chamot, Marlène Dreux, François-Loïc Cosset
Gastroenterology. online: December 5, 2016. 
DOI:http://dx.doi.org/10.1053/j.gastro.2016.11.047
 

 Contact chercheur
* Bertrand Boson
Virus Enveloppés, Vecteurs et Immunothérapie 
Centre International de Recherche en Infectiologie
CNRS UMR 5308-Inserm U1111-ENS de Lyon- Université Claude Bernard Lyon 1 
46 allée d’Italie 
69007 Lyon 
Tel: 04 72 72 87 26

* François-Loïc Cosset
Virus Enveloppés, Vecteurs et Immunothérapie 
Centre International de Recherche en Infectiologie
CNRS UMR 5308-Inserm U1111-ENS de Lyon- Université Claude Bernard Lyon 1 
46 allée d’Italie 
69007 Lyon 
Tel: 04 72 72 87 32

Mise en ligne le 13 décembre 2016

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Un microcircuit cortical pour mieux s’orienter
 
Impliqué dans la cognition spatiale, le presubiculum contient des neurones dont l’activité dépend de la direction de la tête. C’est une véritable boussole dont le fonctionnement reste peu connu. L’équipe de Desdemona Fricker au Centre de neurophysique, physiologie, pathologies révèle chez la souris comment les communications synaptiques entre neurones excitateurs et inhibiteurs permettrait de contrôler la précision du signal au sein du presubiculum. Cette étude a été publiée le 20 juillet 2017 dans la revue Nature Communications.
 
Pour représenter notre environnement et nous y projeter, notre cerveau combine notre perception du monde extérieur et des informations internes, notamment celle du système vestibulaire à la base de notre sens de l’équilibre. Les informations vestibulaires (accélération) permettent de générer, dans le tronc cérébral et l’hypothalamus, des informations directionnelles codées par des neurones appelés « cellules de direction de la tête ». Une cellule de direction de la tête s’active – c’est à dire qu’elle émet des potentiels d’action - seulement quand la tête est tournée dans une direction donnée. Plus précisément, chaque cellule encode une gamme restreinte et continue de directions, et l’ensemble des cellules de direction de la tête permet de représenter toutes les directions. L’information est ensuite transmise au thalamus antérieur, puis à une région corticale du lobe temporal, le présubiculum, dont la moitié des neurones sont des cellules de direction de la tête.

Au sein du présubiculum, des informations visuelles sont combinées au signal et permettent d’ancrer l’activité des neurones, c’est-à-dire qu’une cellule de direction de la tête donnée indique toujours la même direction. En l’absence de repères visuels, les cellules perdent cet ancrage, ce qui pourrait expliquer pourquoi notre cap est rapidement erroné quand on se déplace dans le noir. De plus, le présubiculum raffine le signal, c’est à dire que chaque cellule de direction de la tête s’active pour une gamme de directions beaucoup plus restreinte que dans le thalamus. Ces processus sont très probablement liés au fonctionnement intrinsèque du présubiculum qui reste très peu connu à ce jour.

Les chercheurs montrent comment, dans le présubiculum, un circuit de neurones spécialisé peut soutenir les signaux de direction de tête. Ce réseau, formé par des cellules pyramidales excitatrices et des cellules de Martinotti inhibitrices, a été étudié au moyen d’enregistrements en patch-clamp sur tranches de présubiculum ex vivo couplés à des outils optogénétiques et à de la modélisation.
Les chercheurs ont d’abord établi que le signal directionnel du thalamus antérieur cible les cellules pyramidales, mais pas les cellules de Martinotti. Au sein du présubiculum, ces deux types de neurones sont fortement interconnectés. La synapse excitatrice formée par la cellule pyramidale sur la cellule de Martinotti est facilitatrice, c’est-à-dire qu’elle a besoin d’être stimulée intensément pour libérer des neurotransmetteurs et communiquer l’information. Seules les décharges à haute fréquence, survenant in vivo quand une même direction est maintenue, recruteraient les cellules de Martinotti générant alors un rétrocontrôle inhibiteur. Les résultats montrent ensuite que ce rétrocontrôle inhiberait moins la cellule pyramidale initiant la décharge de la cellule de Martinotti que les cellules voisines. En théorie, les décharges persistantes d’une cellule de direction de la tête exerceraient donc une inhibition, via les cellules de Martinotti, préférentiellement sur les neurones qui ne codent pas la direction de la tête maintenue. Pour tester si ces interactions synaptiques supporteraient le codage de l’information directionnelle, un réseau de neurones a été modélisé à partir des données de l’étude. Les simulations ont montré qu’un tel réseau permettrait en effet de générer une activité cohérente au sein d’une population de cellules de direction de la tête.

Selon Jean Simonnet, ancien doctorant, premier auteur de l’étude « Cette étude originale tente de tisser un lien entre les éléments synaptiques et l’activité corticale liée au comportement et, par conséquent, apporte des éléments nouveaux pour la compréhension des microcircuits neuronaux de la cognition spatiale. Les interprétations quant au rôle du microcircuit dans le contexte de l’orientation doivent maintenant être vérifiées expérimentalement in vivo. »
 

Figure : La décharge persistante à haute fréquence de la cellule pyramidale recrute une cellule de Martinotti. A. Morphologie d’une cellule pyramidale (PC, dendrite en bleu et axone en orange) et d’une cellule de Martinotti (MC, dendrite en vert et axone en rouge) interconnectées. Les lignes discontinues et les nombres indiquent la position des différentes couches corticales du présubiculum (6 en tout). B. Diagramme de phase d’un neurone qui signale la direction de la tête, enregistré in vivo. Toutes les directions sont représentées sur le cadrant circulaire, l’axe radial représente la fréquence de décharge du neurone, qui augmente seulement quand la tête est dirigée vers le coin inférieur gauche de l’environnement. Une cellule pyramidale enregistrée en tranche via la technique de patch clamp (tracé bleu) a été stimulée en utilisant le patron de décharge de la cellule de direction de la tête, c’est-à-dire la séquence temporelle précise des potentiels d’action (PA). Une cellule de Martinotti (traces vertes) reçoit les informations de la cellule pyramidale et y répond préférentiellement à la fin d’une série de potentiels d’actions à haute fréquence. En haut, l’enregistrement montre des courants postsynaptiques excitateurs (EPSCs). En bas, les tracés montrent la décharge de potentiels d’actions (PA).
© Desdemona Fricker. License Creative Commons.


 

En savoir plus
* Activity dependent feedback inhibition may maintain head direction signals in mouse presubiculum 
Jean Simonnet, Mérie Nassar, Federico Stella, Ivan Cohen, Bertrand Mathon, Charlotte N. Boccara, Richard Miles & Desdemona Fricker. 
Nature Communications. Nature Communications 8, Article number: 16032 (2017) doi:10.1038/ncomms16032. Published online: 20 July 2017.



 Contact chercheur
* Desdemona Fricker
Centre de Neurophysique, Physiologie, Pathologies 
CNRS UMR 8119 - Université Paris Descartes
45 rue des Saint-Pères
75006  Paris

    01 42 86 43 70

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Un mécanisme inédit de régulation de la position du sillon de division cellulaire

Des chercheurs de l’Institut de génétique et de développement de Rennes révèlent l’existence d’un mécanisme qui contrôle la position correcte du sillon de division et joue un rôle essentiel dans la répartition du matériel génétique lors de la division cellulaire. Cette étude qui ouvre de nouvelles perspectives pour la compréhension des anomalies génétiques et l’apparition de tumeurs liées à une ségrégation anormale des chromosomes, est publiée dans la revue The Journal of Cell Biology.

Lorsqu’une cellule se divise, son matériel génétique est réparti équitablement entre les deux cellules filles. Cette ségrégation du matériel génétique est une étape essentielle de la division cellulaire car une mauvaise répartition de l’ADN lors de la division provoque une aneuploïdie qui peut notamment conduire à la transformation tumorale des cellules. Plusieurs mécanismes assurent la répartition de l’ADN entre les cellules filles. Tout d’abord la formation du fuseau mitotique permet de séparer les chromosomes en deux lots égaux. Le fuseau mitotique contrôle ensuite la formation d’un sillon de division qui clive la cellule mère entre les deux lots de chromosomes. Une protéine du cytosquelette, la myosine, est aussi capable d’induire la formation d’un sillon de division, indépendamment de la présence du fuseau mitotique. Pourtant, dans certaines cellules, la myosine et le fuseau mitotique sont localisés  à des côtés opposés de la cellule. Dans ces cellules, la position du sillon de division résulte-t-elle d’un équilibre entre les signaux venant du fuseau mitotique et de la myosine ? Ces signaux doivent-ils être régulés pour que la position du sillon permette de ségréger correctement l’ADN ? C’est à ces questions qu’Anne Pacquelet dans l’équipe de Grégoire Michaux, et ses collègues de l’Institut de Génétique et de Développement de Rennes (IGDR), Perrine Uhart et Jean-Pierre Tassan, ont cherché à répondre.
Pour ceci, les chercheurs ont utilisé l’embryon du ver Caenorhabditis elegans au stade de une cellule dont la grande taille permet de visualiser facilement les différentes étapes de la division cellulaire. Dans cette cellule, la myosine s’accumule du côté antérieur en début de division alors que le fuseau mitotique est positionné du côté postérieur. A travers plusieurs expériences de génétique, ils ont découvert que la position du sillon de division coïncide avec celle du fuseau mitotique grâce à plusieurs protéines, l’anilline et les kinases PAR-4/LKB1 et PIG-1/MELK, qui restreignent l’accumulation de myosine active au niveau du sillon en formation. En absence de l’anilline et de PAR-4/LKB1 ou PIG-1/MELK, l’accumulation de myosine est augmentée et prolongée du côté antérieur et ceci provoque un important déplacement  du sillon de division qui ne peut alors cliver entre les deux lots de chromosomes.
Cette étude révèle l’existence d’un mécanisme régulant l’activité de la myosine au cours de la division. Ce mécanisme est essentiel pour que la position du sillon coïncide avec celle du fuseau mitotique, permettant ainsi une ségrégation correcte du matériel génétique. Ce travail ouvre de nouvelles perspectives concernant l’origine possible des anomalies de ségrégation du matériel génétique observées dans les cellules humaines ainsi que le rôle de la kinase PIG-1/MELK qui est connue pour être surexprimée dans de nombreuses tumeurs humaines.

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Identification d’un nouveau gène de malvoyance par atteinte du nerf optique

Les neuropathies optiques héréditaires sont des pathologies mitochondriales cécitantes, pour lesquelles la moitié des patients demeurent en errance de diagnostic génétique. Grâce aux nouvelles technologies de séquençage du génome, une collaboration internationale a identifié des mutations du gène RTN4IP1 dans 4 familles présentant une perte de vision précoce, isolée ou associée à d’autres symptômes neurodégénératifs. L’altération du fonctionnement mitochondrial est incriminée, avec des conséquences secondaires sur la maturation des neurones et une susceptibilité aux effets délétères de la lumière. Ces travaux sont publiés dans la revue The American Journal of Human Genetics.

Les neuropathies optiques héréditaires (NOH) sont des pathologies mitochondriales cécitantes. Seuls 50% des patients ont à l'heure actuelle un diagnostic génétique positif. Une étude conduite par Guy Lenaers* (CNRS UMR 6214, Inserm U1083, Université d'Angers) a permis d’identifier un nouveau gène, RTN4IP1, dont les mutations récessives sont responsables d'une forme isolée de NOH (atteinte de la vision seule) ou syndromique (atteinte de la vision et d'autres fonctions neuronales) dans 4 familles. Ces travaux montrent que l’étiologie de cette maladie est intimement liée à des dysfonctions primaires des mitochondries avec une atteinte du fonctionnement de la chaine respiratoire responsable de la production énergétique, un élément clé de la physiologie des neurones constituant le nerf optique. Les chercheurs démontrent par ailleurs que ces dysfonctions mitochondriales ont des conséquences délétères sur la connectivité et la maturation des neurones, et leur confèrent une susceptibilité accrue aux effets toxiques de la lumière, en particulier ceux générés par les UVs.
Une étude intégrative chez le poisson zèbre, par extinction du gène RTN4IP1 chez la larve, a révélé une altération spécifique du développement des cellules ganglionnaires de la rétine et du nerf optique, induisant un comportement natatoire anormal caractéristique d’une altération des fonctions visuelles, un phénotype récapitulant les observations effectuées chez les patients.
Ce travail permet d'améliorer le démembrement génétique des NOH en proposant un nouveau gène à cribler chez les patients atteints de NOH récessive, et de poursuivre l'étude des mécanismes pathologiques responsables de la dégénérescence précoce du nerf optique chez l’humain.
 
* Ces travaux ont été réalisés à l’Institut des Neurosciences de Montpellier (Inserm U1051) dans l’équipe du Pr. Christian Hamel avec la collaboration du Pôle de Recherche d’Enseignement en Médecine Mitochondriale d’Angers (UMR CNRS 6214, Inserm U1083, Université d’Angers) avec la participation d’équipes de l’université de Newcastle (G-B), de l’université Justus-Liebig (Allemagne) et de l’université de Bologne (Italie) pour le recrutement de patients et le criblage du gène RTN4IP1 au sein de leurs cohortes.

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