Paris, 16 mai 2012

Une nouvelle approche de microscopie optique ouvre la voie à de meilleures observations en biologie moléculaire

Des équipes de chercheurs de l'Institut Pasteur et du CNRS viennent de mettre au point, en combinant deux méthodes récentes d'imagerie, une nouvelle approche de microscopie optique permettant de visualiser des assemblages moléculaires avec une résolution environ 10 fois meilleure que les microscopes traditionnels, tout en respectant leur fonction biologique. Grâce à cette approche, ils ont pu observer, pour la première fois dans une cellule par voie optique, le virus du sida et sa capside (contenant le génome du VIH) à une résolution de 30 nanomètres. L'approche développée représente une avancée majeure, ouvrant la voie à des analyses moins invasives et plus précises de micro-organismes pathogènes présents dans des cellules hôtes humaines vivantes. Cette étude est en ligne sur le site de la revue PNAS.
Depuis toujours, il est nécessaire pour les chercheurs de pouvoir visualiser les virus qu'ils étudient dans l'environnement de leur cellule cible, afin de définir les interactions hôte-pathogène contribuant à l'infection. La microscopie optique, qui utilise des molécules fluorescentes (comme les protéines GFP ou des anticorps couplés à des fluorophores synthétiques) permet de mettre en avant les différentes structures d'une cellule, dont les protéines. Cependant, cette méthode est limitée par son faible pouvoir de résolution, ne pouvant distinguer des structures cellulaires et moléculaires qu'à une échelle de 200 à 300 nanomètres (nm). La plupart des virus étant de taille inférieure, il est nécessaire de recourir à des techniques d'imagerie plus précises, afin de définir leur structure interne.

Une étude coordonnée par le Dr Christophe Zimmer(1) (Institut Pasteur/CNRS), en collaboration avec le Dr Nathalie Arhel(2) au sein du laboratoire du Pr Pierre Charneau(3) (Institut Pasteur/CNRS), révèle que l'association de deux techniques récentes d'imagerie permet d'obtenir des images uniques d'assemblages moléculaires de la capside du VIH-1, avec une résolution environ 10 fois meilleure que les microscopes optiques traditionnels. Cette approche, qui utilise la microscopie super-résolutive PALM et le marquage FlAsH, n'affecte pas la capacité du virus à se répliquer. Elle représente une avancée majeure pour la recherche en biologie moléculaire, permettant de visualiser des complexes microbiens à une échelle de 30 nm dans les cellules sans perturber leur fonction.

L'approche développée combine la microscopie super-résolutive PALM et le marquage FlAsH. La microscopie PALM se fonde sur la prise de milliers de clichés en basse résolution, dont chacun ne montre que quelques molécules fluorescentes. Les positions de ces molécules sont ensuite calculées et assemblées par ordinateur afin d'obtenir une seule image en haute résolution. Le marquage FlAsH, quant à lui, implique la fusion d'un peptide de 6 acides aminés à la protéine étudiée, auquel se lie le fluorophore FlAsH. Cette liaison génère de la fluorescence, permettant ainsi la visualisation de cette protéine. C'est la première fois qu'une équipe de chercheurs regroupe ces deux méthodes afin d'obtenir des images en haute-définition d'une structure moléculaire aussi bien dans des cellules fixées que dans des cellules vivantes.

Grâce à cette nouvelle approche, les chercheurs ont pu visualiser la morphologie du virus du sida à une échelle de 30 nm et localiser sa capside dans des cellules humaines. Les capsides sont des structures coniques qui contiennent le génome du VIH. Ces structures doivent se défaire pour permettre au génome du VIH de s'intégrer dans celui de la cellule hôte. Cependant, la chronologie de ce désassemblage a longtemps été débattue. Selon une hypothèse dominante, la capside se désassemblerait immédiatement après infection de la cellule et ne jouerait donc qu'un rôle marginal dans le voyage intracellulaire du virus vers le noyau. Les résultats obtenus par les chercheurs de l'Institut Pasteur et du CNRS indiquent, au contraire, que de nombreuses capsides restent intactes jusqu'à l'entrée du VIH dans le noyau des cellules, confirmant et renforçant de précédentes études en microscopie électronique. Ainsi, les capsides pourraient jouer un rôle plus important que communément admis dans le cycle réplicatif du virus.

Le développement de cette nouvelle approche de microscopie optique par les chercheurs de l'Institut Pasteur et du CNRS offre des perspectives uniques pour la biologie moléculaire. En effet, cette nouvelle technique d'imagerie pourrait devenir un outil important dans l'analyse de nombreux complexes microbiens et de leurs interactions avec des cellules hôtes à l'échelle moléculaire. Cette technique non-invasive permet d'observer des protéines sans détruire, ni altérer, leur fonction biologique. Par ailleurs, elle pourrait, à terme, rendre possible l'analyse de micro-organismes à des résolutions de l'ordre du nanomètre, permettant ainsi de passer de la microscopie à la « nanoscopie ». La prochaine étape sera, par conséquent, le partage de cette approche avec la communauté scientifique, son développement et son application à l'étude d'autres micro-organismes pathogènes.

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Paris, 26 avril 2012

Une nouvelle espèce de bactérie forme des minéraux intracellulaires

Une nouvelle espèce de bactérie photosynthétique vient d'être mise en évidence : elle est capable de contrôler la formation de minéraux (carbonates de calcium, magnésium, baryum, strontium), à l'intérieur même de son organisme. Publiée dans Science le 27 avril 2012, une étude menée par des chercheurs français(1) révèle l'existence de ce nouveau type de biominéralisation dont le mécanisme est encore inconnu. Cette découverte a d'importantes implications pour l'interprétation du registre fossile ancien.
Les cyanobactéries focalisent depuis longtemps l'attention des scientifiques. Capables de photosynthèse(2), ces micro-organismes ont joué un rôle majeur dans l'histoire de la Terre, conduisant notamment à l'oxygénation de l'atmosphère. Certaines cyanobactéries sont capables de former des carbonates de calcium(3) à l'extérieur de leur cellule, notamment celles associées aux stromatolites, des roches carbonées qui datent d'environ 3,5 milliards d'années et comptent parmi les plus anciennes traces de vie sur Terre. Des cyanobactéries fossiles pourraient donc se retrouver au sein de ce type de formation. Pourtant, les premières cyanobactéries fossiles datent seulement de 700 millions d'années bien après le début de l'oxygénation de la Terre qui remonterait à 2,3 milliards d'années. Pourquoi un tel laps de temps ?

Une équipe française(1) vient peut-être d'apporter une réponse. Dans des stromatolites recueillis dans un lac de cratère mexicain et cultivés au laboratoire, les scientifiques ont mis en évidence une nouvelle espèce de cyanobactérie, baptisée Candidatus Gloeomargarita lithophora. Ce micro-organisme est issu d'une lignée qui a divergé précocement chez les cyanobactéries. Sa principale caractéristique : grâce à un mécanisme de biominéralisation encore inconnu, cette cyanobactérie fabrique des nanoparticules de carbonate de calcium intracellulaires, d'environ 270 nanomètres (soit 270 milliardièmes de mètres). Si l'on connaissait l'existence de cyanobactéries capables de former du carbonate de calcium extracellulaire au sein des stromatolites, c'est la première fois que l'on révèle une formation à l'intérieur de la cellule. Autre particularité de cette nouvelle espèce : elle accumule le strontium et le baryum pour l'incorporer aux carbonates.

Cette découverte a d'importantes implications pour l'interprétation du registre fossile ancien. En effet, si les cyanobactéries associées aux stromatolites formaient des carbonates à l'intérieur de leurs cellules et non pas à l'extérieur, elles n'auraient pas été préservées dans le registre fossile et pourraient expliquer le laps de temps entre leur apparition (il y a au moins 2,3 milliards d'années) et les plus vieux fossiles retrouvés (il y a 700 millions d'années). Reste désormais à découvrir pourquoi et comment cette cyanobactérie fabrique ce carbonate de calcium.

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Paris, 20 mars 2012

Une protéine à la fluorescence inégalée pour illuminer les cellules de l'intérieur

Des scientifiques du CNRS, de l'ESRF, du CEA, de l'Université Joseph Fourier et des Universités d'Amsterdam et d'Oxford ont réussi à créer une molécule capable d'éclairer l'intérieur des cellules vivantes avec une lumière turquoise, trois fois plus brillante qu'auparavant. Cette nouvelle molécule permettra d'étudier les interactions entre protéines à l'intérieur de cellules vivantes avec un niveau de sensibilité inégalée : une avancée en imagerie cellulaire qui fait l'objet d'une publication le 20 mars 2012 dans Nature Communications.
Les protéines fluorescentes cyan (CFP) sont très utilisées en biologie cellulaire car elles rendent visibles, comme dans un film, les processus à l'œuvre à l'intérieur d'une cellule et les changements de conformation des molécules biologiques. Elles permettent, depuis le début des années 1990, d'observer des processus auparavant invisibles, comme le développement des cellules nerveuses dans le cerveau ou la propagation des cellules cancéreuses dans le corps. Cependant, ces molécules ont longtemps souffert d'un signal de fluorescence faible, ne convertissant à peine que 36 % de la lumière bleue incidente en lumière cyan (1).

Afin de pallier ce problème et d'améliorer la technique, l'équipe dirigée par Antoine Royant de l'Institut de Biologie Structurale (CNRS/CEA/Université Joseph Fourier) et les chercheurs des Universités d'Amsterdam et d'Oxford et de l'ESRF (European Synchrotron Radiation Facility) ont collaboré à un travail de recherche en trois étapes.

D'abord, l'équipe de Grenoble, avec celle d'Oxford, a décelé grâce aux rayons X du synchrotron ESRF, d'infimes détails qui ont permis d'expliquer comment les CFP stockent l'énergie incidente avant de la réémettre sous forme de lumière fluorescente. Les chercheurs ont produit des cristaux microscopiques de ces CFP améliorées, les ont soumis aux rayons X du synchrotron ESRF, et ont ainsi pu inspecter le chromophore, le « coeur » de la CFP à l'origine de l'émission de lumière et donc responsable de l'efficacité de fluorescence. Ils ont pu comprendre la fonction de différents atomes individuels à l'intérieur des CFP et identifier la partie de la molécule qui avait besoin d'être modifiée pour augmenter le signal de fluorescence.

En parallèle, l'équipe d'Amsterdam dirigée par le Professeur Theodorus Gadella s'est servie d'une technique de criblage innovante pour étudier des centaines de molécules CFP modifiées, mesurant leur durée de vie de fluorescence au microscope, afin d'identifier les protéines dont les propriétés avaient été améliorées.

Le résultat de cette conception rationnelle est une nouvelle CFP, appelée mTurquoise2. En combinant leurs efforts de biologie structurale et cellulaire, les chercheurs ont pu montrer que mTurquoise2 avait un niveau de fluorescence de 93 %, jamais atteint jusqu'ici pour ce type de protéine.

Cette nouvelle molécule permettra d'étudier les interactions entre protéines à l'intérieur de cellules vivantes avec un niveau de sensibilité inégalé. La haute sensibilité est cruciale pour les réactions rapides où le temps nécessaire pour l'accumulation de la lumière fluorescente est très court et dans des processus biologiques où quelques protéines seulement sont impliquées et les signaux extrêmement faibles. Grâce à cette nouvelle protéine, de nombreuses recherches pourront être réalisées avec des niveaux de précision et de détail jamais égalés. Par cette nouvelle approche basée sur la connaissance de la dynamique structurale de la protéine, les chercheurs espèrent maintenant concevoir des protéines fluorescentes améliorées avec des couleurs différentes pour d'autres applications.

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Biologie de synthèse

Les méthodes spécifiques aux biotechnologies "classiques" sont artisanales : on extrait un gène spécifique du patrimoine génétique d'un organisme naturel et on le transfère dans un autre organisme, qui peut produire la protéine associée à ce gène avec une vitesse et un rendement supérieur.

C'est en combinant les concepts de la biologie des systèmes, dont le but est de comprendre les systèmes biologiques complexes dans leur globalité, avec les biotechnologies, qui ont des objectifs technologiques, que la biologie de synthèse a vu le jour. Cette dernière vise non seulement la synthèse directe d'un gène par des technique chimiques, de génie génétique ou spécifiques aux nanotechnologies, mais aussi l'utilisation des méthodes issues des sciences d'ingénieur comme l'informatique ou l'automatique pour concevoir de façon rationnelle de nouveaux systèmes biologiques.

Plusieurs stratégies existent :

 L'approche dite "top-down" consiste à modifier un système biologique naturel pour obtenir un système plus simple, plus facile à comprendre et à manipuler. On peut par exemple prendre une bactérie, lui retirer une bonne partie de ses gènes, en ne gardant que le minimum nécessaire à sa survie en conditions de laboratoire, comme c'est le cas du projet "Mycoplasma laboratorium" de l'Institut J. Craig Venter. Un autre exemple est le projet "Synthia", porté par le même laboratoire, où l'ADN naturel de la bactérie a été entièrement remplacé par un ADN synthétique.

 La démarche opposée, dite "bottom-up", consiste à définir des briques élémentaires ayant des fonctions bien définies puis à les assembler pour fabriquer des systèmes biologiques sur mesure, comme dans un jeu de lego. Cette stratégie est adoptée dans le cadre du concours de biologie de synthèse iGEM, hébergé par le MIT, auquel participent chaque année un millier d'étudiants.

 On peut aller encore plus loin et réaliser des "proto-cellules", vésicules dotées d'une paroi semblable aux membranes des cellules vivantes, qui peuvent absorber sélectivement de petites molécules et les transformer à l'intérieur, grâce à une machinerie cellulaire simple. Les proto-cellules peuvent réaliser diverses fonctions, par exemple détecter et signaler une anomalie de santé, avant l'apparition des symptômes. En particulier, des proto-cellules lancées dans le système digestif et éliminées naturellement peuvent être utilisées comme méthode non-invasive de diagnostic.

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