Contrôle d'une cellule assisté par ordinateur
 

Des chercheurs du laboratoire Matière et Systèmes Complexes et de l'équipe Contraintes de l'INRIA Rocquencourt ont montré qu'il était possible de contrôler en temps réel l'expression génique chez la levure. Cette approche est originale en ce sens qu'ils ont utilisé une boucle de rétroaction pilotée par un ordinateur pour contrôler directement une population de cellules, voire une seule cellule. En bref, ils ont mis en interface une cellule avec un ordinateur ce qui leur permet de faire varier le niveau d'expression des gènes dans le temps selon un profil choisit par l'utilisateur et avec une bonne précision quantitative. Cette approche est très innovante et ouvre des perspectives d'application dans le domaine de la biologie synthétique et des biotechnologies, notamment pour la production de molécules d'intérêts par des cellules.

Contrôler, pour mieux le comprendre et mieux l'utiliser, le fonctionnement des cellules est l'un des enjeux majeurs de la biologie moderne. L'ingénierie génétique et la modélisation des fonctions du vivant permettent ainsi de reprogrammer certaines cellules pour les transformer en micro usine produisant des molécules d'intérêts. Plus généralement, la biologie synthétique permet de détourner des fonctions biologiques existantes élémentaires, de les relier et de les modifier pour réaliser des fonctions nouvelles, ayant des intérêts fondamentaux ou technologiques. Outre l'ingénierie de voie métabolique chez les bactéries ou la levure pour produire des protéines d'intérêts biotechnologiques, on peut citer la réalisation synthétique de fonctions logiques élémentaires (AND, OR, XOR…), permettant de transformer des cellules en mini-calculateur. Ces modifications génétiques permettent d'envisager la création de bio-capteurs multi-fonctions. Les fonctions implémentables souffrent cependant des limitations inhérentes aux systèmes biologiques : la transcription des gènes est un processus stochastique et le niveau d'expression des gènes peut varier grandement d'une cellule à l'autre, même lorsque celles-ci sont cultivées dans des conditions identiques. Il est alors difficile d'obtenir des fonctions complexes, telles que des oscillations, qui soient identiques d'une cellule à l'autre et présentent des propriétés dynamiques satisfaisantes.

Pour contourner ce problème, il est important d'accroitre notre capacité à contrôler les processus cellulaires. Depuis plusieurs années maintenant, il est possible d'induire l'expression d'un gène d'intérêt via l'utilisation d'un promoteur dit inductible et d'une stimulation bien choisie, comme par exemple l'ajout d'une molécule ou d'un métabolite. Mais pour chaque gène d'intérêt, il reste difficile, voire impossible, d'obtenir un contrôle quantitatif sur des temps longs. En effet, les modèles décrivant l'induction de l'expression d'un gène particulier sont souvent incomplets et ne peuvent prendre en compte tous les effets d'interactions et de régulation interne ayant lieu à l'échelle cellulaire. De plus, la variabilité dans l'expression des gènes pose un problème fondamental pour la prédiction à long terme de la nature de la stimulation à utiliser. Ainsi, il n'est pas possible de forcer l'expression d'un gène à suivre un profil temporel quelconque sans devoir adapter le niveau de la stimulation de temps à autre. Faire une telle correction dynamique est une approche classique en théorie du contrôle, mais qui n'avait pas encore été appliqué au vivant jusqu'à très récemment [1-4].

Avec l'équipe de Grégory Batt (Contraintes, INRIA-Rocquencourt) et en collaboration avec les groupes de Frédéric Devaux (Paris 6) et de Gilles Charvin (IGBMC), les chercheurs du laboratoire Matière et systèmes complexes ont développé une plateforme mêlant microscopie de fluorescence pour observer des cellules de levure (Saccharomyces Cerevisiae), micro-fluidique pour changer leur environnement et un processus de contrôle piloté par ordinateur [1]. Ils sont ainsi capables d'observer en temps réel le niveau d'expression d'un gène grâce à un marquage par fluorescence et d'adapter la stimulation afin que ce niveau de fluorescence suive un profil donné. En d'autres termes ils ont réalisé une plateforme permettant de connecter une assemblée de cellules à un ordinateur ; point de départ pour réaliser des interactions cellule machine plus complexes. Une approche similaire a récemment été proposée par le groupe de John Lygeros de l'ETH [2] qui a réussi à forcer une population de cellules à exprimer un gène à un niveau constant pendant plusieurs heures. L'équipe de Wendel Lim [3] et de Diego di Bernardo [4] ont également proposé des stratégies conceptuellement proches. Les travaux récemment réalisés ajoutent la possibilité d'observer chaque cellule individuellement et ont permis de démontrer qu'il est possible de forcer l'expression d'un gène sur des temps longs (> 15h) selon des profils variables dans le temps. Il est important de noter que ce modèle d'induction génique est basé sur la réponse osmotique de la levure, une voie de réponse au stress bien connue et présentant un fort degré de régulation interne avec une adaptation à moyen terme : après un certain temps, les cellules ne ressentent plus la stimulation. Il s'agit donc a priori d'un système difficile à contrôler. Le contrôle externe permet malgré tout de surpasser les niveaux de régulation interne. Finalement, il est désormais possible de suivre une cellule isolée et de la contrôler directement, ce qui réduit le niveau de bruit de l'expression génique pour cette cellule par rapport au cas d'un contrôle global de la population.

Les chercheurs envisagent maintenant de développer cette plateforme pour d’autres organismes modèles et de l’utiliser pour améliorer notre compréhension des fonctions cellulaires. En effet, il est maintenant possible de perturber, précisément le niveau d’un gène impliqué dans une fonction naturelle ou synthétique et d’étudier l’impact de variations fines de son niveau par rapport à l’état physiologique de référence. L’ajout d’une couche logicielle permet d’étendre considérablement les capacités des promoteurs inductibles classiques, tant du point de vue de leurs dynamiques que de celui de leur robustesse et de leur résistance aux bruits biologiques. L’utilisation de systèmes hybrides « ordinateur – cellules » comme une boucle de contrôle externe permettra de simplifier considérablement la création de fonctions synthétiques complexes et de s’assurer que celles-ci aient un comportement robuste et précis en toute circonstance.

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Paris, 7 septembre 2012

Observer en temps réel la réparation d'une seule molécule d'ADN
L'ADN est sans cesse endommagé par des agents environnementaux tels que les rayons ultra-violets ou certaines molécules de la fumée de cigarette. Sans arrêt, les cellules mettent en œuvre des mécanismes de réparation de cet ADN d'une efficacité redoutable. Une équipe de l'Institut Jacques Monod (CNRS/Université Paris Diderot), en collaboration avec des chercheurs des universités de Bristol en Angleterre et Rockefeller aux Etats-Unis, est parvenue à suivre en direct, pour la première fois, les étapes initiales de l'un de ces systèmes de réparation de l'ADN encore peu connu. Grâce à une technique inédite appliquée à une molécule unique d'ADN sur un modèle bactérien, les chercheurs ont compris comment plusieurs acteurs interagissent pour réparer l'ADN avec une grande fiabilité. Publiés dans Nature le 9 septembre 2012, leurs travaux visent à mieux comprendre l'apparition de cancers et comment ils deviennent résistants aux chimiothérapies.
Les rayons ultra-violets, la fumée de tabac ou encore les benzopyrènes contenus dans la viande trop cuite provoquent des altérations au niveau de l'ADN de nos cellules qui peuvent conduire à l'apparition de cancers. Ces agents environnementaux détériorent la structure même de l'ADN, entraînant notamment des dégâts dits « encombrants » (comme la formation de ponts chimiques entre les bases de l'ADN). Pour identifier et réparer ce type de dégâts, la cellule dispose de plusieurs systèmes, comme la « réparation transcriptionellement-couplée » (ou TCR pour Transcription-coupled repair system) dont le mécanisme d'action complexe reste encore aujourd'hui peu connu. Des anomalies dans ce mécanisme TCR, qui permet une surveillance permanente du génome, sont à l'origine de certaines maladies héréditaires comme le Xeroderma pigmentosum qui touche les « enfants de la Lune », hypersensibles aux rayons ultra-violets du Soleil.

Pour la première fois, une équipe de l'Institut Jacques Monod (CNRS/Université Paris Diderot), en collaboration avec des chercheurs des universités de Bristol en Angleterre et Rockefeller aux Etats-Unis, a réussi à observer les étapes initiales du mécanisme de réparation TCR sur un modèle bactérien. Pour y parvenir, les chercheurs ont employé une technique inédite de nanomanipulation de molécule individuelle(1) qui leur a permis de détecter et suivre en temps réel les interactions entre les molécules en jeu sur une seule molécule d'ADN endommagée. Ils ont élucidé les interactions entre les différents acteurs dans les premières étapes de ce processus TCR. Une première protéine, l'ARN polymérase(2), parcourt normalement l'ADN sans encombre mais se trouve bloquée lorsqu'elle rencontre un dégât encombrant, (tel un train immobilisé sur les rails par une chute de pierres). Une deuxième protéine, Mfd, se fixe à l'ARN polymérase bloquée et la chasse du rail endommagé afin de pouvoir ensuite y diriger les autres protéines de réparation nécessaires à la réparation du dégât. Les mesures de vitesses de réaction ont permis de constater que Mfd agit particulièrement lentement sur l'ARN polymérase : elle fait bouger la polymérase en une vingtaine de secondes. De plus, Mfd déplace bien l'ARN polymérase bloquée mais  reste elle-même ensuite associée à l'ADN pendant des temps longs (de l'ordre de cinq minutes), lui permettant de coordonner l'arrivée d'autres protéines de réparation au site lésé.

Si les chercheurs ont expliqué comment ce système parvient à une fiabilité de presque 100%, une meilleure compréhension de ces processus de réparation est par ailleurs essentielle pour savoir comment apparaissent les cancers et comment ils deviennent résistants aux chimiothérapies.

Notes :
(1) Dans ces expériences de nanomanipulation, l'ADN endommagé est greffé à une surface de verre d'un côté et une microbille magnétique de l'autre. La bille permet d'étendre l'ADN perpendiculairement à la surface et de mesurer son extension bout-à-bout par vidéomicroscopie. La fixation à l'ADN de diverses protéines, ainsi que leur action, est identifiable par la modification que la protéine génère dans la structure ou conformation de l'ADN. Cette technique permet une analyse structurelle et cinétique extrêmement fine de réactions biochimiques in vitro.
(2) L'ARN polymérase est responsable de la lecture de l'ADN d'un gène et sa réécriture sous forme d'ARN, processus connu sous le nom de « transcription ».Il s'avère que l'ARN polymérase ne transcrit pas seulement les gènes, mais également l'ADN entre les gènes (jusqu'à récemment surnommé ADN « poubelle »), permettant par exemple à l'ARN polymérase d'effectuer son contrôle-qualité par TCR sur le génome entier d'un organisme.

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Paris, 18 septembre 2012

Un éclairage neurologique sur l'origine de l'obésité
Si certains neurones dans notre cerveau contrôlent la prise alimentaire, ils coordonnent également l'activité des organes comme le foie, le pancréas ou les muscles afin d'optimiser l'utilisation des nutriments (lipides, sucres). Des chercheurs du laboratoire Biologie fonctionnelle adaptative (CNRS/Université Paris Diderot) viennent de mettre en évidence cette nouvelle fonction essentielle, chez la souris. Publiés sur le site d'EMBO Journal le 18 septembre 2012, ces travaux renforcent l'hypothèse selon laquelle le cerveau pourrait être le siège du dérèglement initial conduisant aux pathologies associées à l'obésité comme le diabète de type 2, les maladies cardiovasculaires ou les dyslipidémies.
L'obésité est désormais considérée comme une « épidémie » mondiale. La grande majorité de la mortalité associée à l'obésité résulte de complications métaboliques secondaires comme le diabète, les dyslipidémies et les maladies cardiovasculaires (syndrome métabolique). Or, une ingestion excessive d'aliments ne peut pas seule expliquer le lien entre l'obésité et les maladies associées. Ce n'est pas uniquement la quantité de ce que l'on mange qui est à prendre en compte mais la façon dont l'organisme est capable de gérer cet apport, en particulier le choix entre utilisation ou stockage des lipides et des sucres.

Une équipe du laboratoire Biologie fonctionnelle adaptative (CNRS/Université Paris Diderot)1 vient d'identifier le rôle d'un groupe de neurones dans le cerveau (situés dans l'hypothalamus et produisant le neuropeptide AgRP ) qui contrôle le destin des nutriments au niveau des organes comme le pancréas, le foie ou les muscles. Les chercheurs ont montré que des souris déficientes en neurones AgRP et nourries avec un régime normal, deviennent obèses. Par contre, lorsqu'on les nourrit avec un régime riche en gras (hyperlipidique), les animaux améliorent leur métabolisme au glucose. Ces expériences révèlent donc que les neurones AgRP, déjà connus pour contrôler la prise alimentaire, agissent également sur le partitionnement des aliments, notamment via leur action de « chef d'orchestre » auprès du pancréas, du foie et des différents types de muscles. La perte des neurones AgRP change la consigne au niveau central qui définit l'équilibre entre l'utilisation des sucres ou des lipides rendant alors l'animal mieux adapté à un régime gras.

Un déséquilibre dans la capacité du cerveau à coordonner ces tissus pourrait expliquer l'apparition simultanée de dysfonctionnements métaboliques au niveau de plusieurs organes, comme c'est le cas dans la mise en place du syndrome métabolique, à savoir l'ensemble des pathologies associées à l'obésité. Ainsi, la compréhension de l'ensemble de ces processus pourrait apporter des pistes thérapeutiques pour le traitement de ces maladies métaboliques.

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Paris, 16 février 2012

Quand votre main gauche mime ce que fait votre main droite : une histoire de gène
Des chercheurs de l'Inserm, du CNRS, de l'UPMC et de l'AP-HP au sein du Centre de Recherche de l'Institut du Cerveau et de la Moelle (CRICM) de la Pitié-Salpêtrière, viennent de mettre en évidence des mutations à l'origine de la maladie des Des chercheurs de l'Inserm, du CNRS, de l'UPMC et de l'AP-HP au sein du Centre de Recherche de l'Institut du Cerveau et de la Moelle (CRICM) de la Pitié-Salpêtrière, viennent de mettre en évidence des mutations à l'origine de la maladie des mouvements en miroir congénitaux. Les personnes atteintes de cette maladie ont perdu la capacité de réaliser un mouvement différent des deux mains. Grâce au séquençage du génome de plusieurs membres d'une même famille française, le gène RAD51 a été identifié. Des travaux complémentaires menés chez la souris suggèrent qu'il s'agit d'un gène impliqué dans le croisement des voies motrices. Ce croisement est un point clé de transmission des informations cérébrales puisqu'il permet à la partie droite du cerveau de contrôler la partie gauche du corps et inversement.
Ces travaux sont publiés dans la revue The American Journal of Human Genetics.
Les mouvements en miroir congénitaux constituent une maladie rare qui se transmet de génération en génération selon un mode dit dominant. Les personnes atteintes ont perdu la capacité de réaliser un mouvement différent des deux mains : lorsqu'une main effectue un mouvement, l'autre main est « obligée » d'effectuer le même mouvement, même contre la volonté du sujet. Dans cette maladie, il est donc rigoureusement impossible d'avoir une activité motrice bi-manuelle telle que jouer du piano par exemple. Il arrive que l'on observe ces phénomènes chez les enfants, mais ils disparaissent généralement spontanément avant l'âge de 10 ans, surement grâce à la maturation des réseaux de neurones moteurs. Toutefois chez les personnes malades, les symptômes de la maladie débutent dès la petite enfance et restent inchangés tout au long de la vie.

En 2010, des chercheurs québécois ont découvert un gène responsable de la maladie grâce à l'analyse du génome des membres d'une grande famille canadienne. Des mutations avaient été identifiées dans le gène DCC (Deleted in Colorectal Carcinoma). Après cette découverte, l'équipe de chercheurs et de médecins coordonnée par Emmanuel Flamand-Roze a donc cherché des mutations de ce gène chez plusieurs membres d'une famille française atteinte de la maladie des mouvements en miroir congénitaux : sans succès. « Le gène DCC était intact » explique Emmanuel Flamand-Roze.  « Alors que l'on croyait toucher au but, il a donc fallut chercher une mutation dans un autre gène » ajoute-t-il.

Par une approche couplant une analyse génétique conventionnelle et une analyse en « whole exome » (une technique d'analyse génétique de nouvelle génération permettant le séquençage entier de la partie signifiante du génome) les chercheurs ont démontré que le gène RAD51 était responsable de la maladie des mouvements en miroir congénitaux dans une grande famille française et confirmé ce résultat dans une famille allemande atteinte de la même maladie.

« Le gène RAD51 était bien connu de la communauté scientifique pour son rôle potentiel dans la survenue de certains cancers et dans les phénomène de résistance aux chimiothérapies » explique Emmanuel Flamand-Roze. Nous avons donc cherché s'il pouvait avoir une fonction différente pouvant expliquer les symptômes moteurs de cette maladie.

Le système moteur se constitue chez l'homme selon une organisation croisée : le cerveau gauche commandant la motricité du côté droit et réciproquement, avec un croisement qui s'effectue au niveau du tronc cérébral. En étudiant l'expression de la protéine RAD51 au cours du développement du système moteur chez la souris, les chercheurs ont découvert que ce gène pourrait être impliqué dans le croisement des voies motrices reliant le cerveau à la moelle épinière au niveau du tronc cérébral.

Cette découverte ouvre un champ complètement nouveau d'investigation pour la connaissance du développement du système moteur et pour une meilleure compréhension des mécanismes cérébraux qui contrôlent la motricité bi-manuelle (très mal connus). Elle pourrait ainsi permettre d'apporter un éclairage sur d'autres désordres moteurs impliquant une altération de l'organisation fine du mouvement tels que la dystonie ou sur certaines maladies génétiques neuro-développementales.

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