Paris, 16 mai 2012

Une nouvelle approche de microscopie optique ouvre la voie à de meilleures observations en biologie moléculaire
Des équipes de chercheurs de l'Institut Pasteur et du CNRS viennent de mettre au point, en combinant deux méthodes récentes d'imagerie, une nouvelle approche de microscopie optique permettant de visualiser des assemblages moléculaires avec une résolution environ 10 fois meilleure que les microscopes traditionnels, tout en respectant leur fonction biologique. Grâce à cette approche, ils ont pu observer, pour la première fois dans une cellule par voie optique, le virus du sida et sa capside (contenant le génome du VIH) à une résolution de 30 nanomètres. L'approche développée représente une avancée majeure, ouvrant la voie à des analyses moins invasives et plus précises de micro-organismes pathogènes présents dans des cellules hôtes humaines vivantes. Cette étude est en ligne sur le site de la revue PNAS.
Depuis toujours, il est nécessaire pour les chercheurs de pouvoir visualiser les virus qu'ils étudient dans l'environnement de leur cellule cible, afin de définir les interactions hôte-pathogène contribuant à l'infection. La microscopie optique, qui utilise des molécules fluorescentes (comme les protéines GFP ou des anticorps couplés à des fluorophores synthétiques) permet de mettre en avant les différentes structures d'une cellule, dont les protéines. Cependant, cette méthode est limitée par son faible pouvoir de résolution, ne pouvant distinguer des structures cellulaires et moléculaires qu'à une échelle de 200 à 300 nanomètres (nm). La plupart des virus étant de taille inférieure, il est nécessaire de recourir à des techniques d'imagerie plus précises, afin de définir leur structure interne.

Une étude coordonnée par le Dr Christophe Zimmer(1) (Institut Pasteur/CNRS), en collaboration avec le Dr Nathalie Arhel(2) au sein du laboratoire du Pr Pierre Charneau(3) (Institut Pasteur/CNRS), révèle que l'association de deux techniques récentes d'imagerie permet d'obtenir des images uniques d'assemblages moléculaires de la capside du VIH-1, avec une résolution environ 10 fois meilleure que les microscopes optiques traditionnels. Cette approche, qui utilise la microscopie super-résolutive PALM et le marquage FlAsH, n'affecte pas la capacité du virus à se répliquer. Elle représente une avancée majeure pour la recherche en biologie moléculaire, permettant de visualiser des complexes microbiens à une échelle de 30 nm dans les cellules sans perturber leur fonction.

L'approche développée combine la microscopie super-résolutive PALM et le marquage FlAsH. La microscopie PALM se fonde sur la prise de milliers de clichés en basse résolution, dont chacun ne montre que quelques molécules fluorescentes. Les positions de ces molécules sont ensuite calculées et assemblées par ordinateur afin d'obtenir une seule image en haute résolution. Le marquage FlAsH, quant à lui, implique la fusion d'un peptide de 6 acides aminés à la protéine étudiée, auquel se lie le fluorophore FlAsH. Cette liaison génère de la fluorescence, permettant ainsi la visualisation de cette protéine. C'est la première fois qu'une équipe de chercheurs regroupe ces deux méthodes afin d'obtenir des images en haute-définition d'une structure moléculaire aussi bien dans des cellules fixées que dans des cellules vivantes.

Grâce à cette nouvelle approche, les chercheurs ont pu visualiser la morphologie du virus du sida à une échelle de 30 nm et localiser sa capside dans des cellules humaines. Les capsides sont des structures coniques qui contiennent le génome du VIH. Ces structures doivent se défaire pour permettre au génome du VIH de s'intégrer dans celui de la cellule hôte. Cependant, la chronologie de ce désassemblage a longtemps été débattue. Selon une hypothèse dominante, la capside se désassemblerait immédiatement après infection de la cellule et ne jouerait donc qu'un rôle marginal dans le voyage intracellulaire du virus vers le noyau. Les résultats obtenus par les chercheurs de l'Institut Pasteur et du CNRS indiquent, au contraire, que de nombreuses capsides restent intactes jusqu'à l'entrée du VIH dans le noyau des cellules, confirmant et renforçant de précédentes études en microscopie électronique. Ainsi, les capsides pourraient jouer un rôle plus important que communément admis dans le cycle réplicatif du virus.

Le développement de cette nouvelle approche de microscopie optique par les chercheurs de l'Institut Pasteur et du CNRS offre des perspectives uniques pour la biologie moléculaire. En effet, cette nouvelle technique d'imagerie pourrait devenir un outil important dans l'analyse de nombreux complexes microbiens et de leurs interactions avec des cellules hôtes à l'échelle moléculaire. Cette technique non-invasive permet d'observer des protéines sans détruire, ni altérer, leur fonction biologique. Par ailleurs, elle pourrait, à terme, rendre possible l'analyse de micro-organismes à des résolutions de l'ordre du nanomètre, permettant ainsi de passer de la microscopie à la « nanoscopie ». La prochaine étape sera, par conséquent, le partage de cette approche avec la communauté scientifique, son développement et son application à l'étude d'autres micro-organismes pathogènes.

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LE  COLTAN

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 Le syndrôme du membre fantôme

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Paris, 26 novembre 2003

Tromper le cerveau pour alléger la douleur
A l'Institut des sciences cognitives (CNRS - université de Lyon 1) la chercheuse Angela Sirigu, responsable de l'équipe de neuropsychologie, et le médecin Pascal Giraux, du Centre hospitalier universitaire de Saint-Etienne, sondent les connexions entre les régions du cerveau qui commandent le mouvement et celles de la perception de la douleur. Ce qui les a menés sur cette voie, c'est un phénomène appelé « douleur fantôme », où les patients atteints d'une amputation continuent à souffrir, de façon aiguë, du membre pourtant disparu. Ce même mal existe chez les patients souffrant d'une «avulsion du plexus brachialis» (BPA) où une partie du système nerveux périphérique, au niveau de la clavicule, se trouve comme arrachée (1). Dans leur étude publiée par NeuroImage en novembre 2003, la chercheuse et le clinicien ont cherché à faire disparaître la douleur fantôme de patients atteints de BPA en modifiant l'activité du cerveau par une illusion visuelle.

La perception de la position de nos membres est construite à partir d'informations visuelles, tactiles, proprioceptives (2) et de la commande motrice du cerveau (dite " efférente "). Le cortex sensorimoteur primaire joue un rôle essentiel parmi les régions impliquées dans ce processus (appelées aussi S1 et M1). S1 et M1 contiennent chacune une carte précise des parties de notre corps et conservent des capacités considérables de plasticité à l'âge adulte, en particulier lors de modifications des afférences périphériques (3). Le phénomène de membre fantôme chez les patients amputés, défini par la persistance de sensations motrices du membre manquant, est un exemple fascinant d'une telle réorganisation.

L'étude porte sur trois patients souffrant d'une paralysie de la main ou du bras provoquée par une BPA. Dans le cas de ces patients, le membre est toujours présent mais complètement paralysé et dépourvu de toute sensation (ou " dé-afferenté ") car la transmission nerveuse entre le cerveau et le système nerveux périphérique a été interrompue (4). Les trois patients souffraient de douleurs du membre fantôme. L'activité du cortex moteur (ou M1) est mesurée par Imagerie par résonance magnétique fonctionnelle (IRMf) avant et après un entraînement visuo-moteur. Durant huit semaines, les patients ont appris à associer des " mouvements volontaires " du membre fantôme (effectués par le bras et la main lésés) à des mouvements préenregistrés de la main saine (obtenus par une inversion droite-gauche à l'aide d'un montage vidéo et d'un logiciel sophistiqué). Avant l'entraînement, les mouvements " fantômes " du côté lésé activaient une région voisine du cortex moteur, le cortex prémoteur contralatéral. Cependant ils n'activaient pas le cortex moteur (M1) alors que celui ci est activé lors des mouvements de la main saine. Après l'entraînement, deux sujets ont montré une activité plus importante dans cette aire motrice primaire contralatérale (M1). Parallèlement à ce changement, la douleur fantôme se réduisait significativement. Le troisième sujet n'a montré aucune augmentation de l'activité cortex motrice et aucune amélioration de la douleur fantôme.

 Notes :
(1) Souvent à la suite d'accidents de la route.
(2) Les informations proprioceptives sont plus élaborées que la simple sensation ; elles permettent de situer la position des membres dans l'espace, le sens donné à un mouvement…
(3) Les informations afférentes sont impulsées du système nerveux périphérique vers le cerveau, par opposition aux informations efférentes.
(4) Au niveau des racines nerveuses qui partent de la moelle épinière et innervent les muscles du membre supérieur.

 Dans cette étude, les résultats montrent que l'apprentissage visuel des " mouvements " du membre paralysé a modifié d'une manière remarquable l'activité dans le cortex moteur. Pour les auteurs, l'entraînement visuo-moteur réussi a restauré une image cohérente du corps dans M1, qui à son tour, a affecté directement la sensation de douleur fantôme. La vision du membre paralysé en mouvement pourrait avoir ainsi " trompé " le cerveau et rétabli l'activité neuronale dans la région motrice importante pour la représentation de la main. Ces travaux ouvrent la voie à une rééducation thérapeutique, basée sur cette nouvelle technique visuo-motrice.

Une question toutefois reste en suspens : le lien étroit qui existe entre la restauration de l'activité de M1 et la diminution de la douleur fantôme. Pourquoi le troisième patient a-t-il réagi différemment ? Parce que son accident est bien plus antérieur et qu'il lui faudrait davantage de séances de rééducation ? Ainsi ce travail, soutenu financièrement par la région Rhône-Alpes, constitue une première étude. Dès ses premiers travaux en 1996, A. Sirigu cherchait à comprendre comment un cerveau lésé empêche d'exécuter ou d'imaginer des mouvements. Dans cette deuxième étape, elle observe comment des membres lésés peuvent influer le fonctionnement du cerveau. Elle avait ainsi mis à jour avec P. Giraux en 2001 l'étonnante plasticité du cerveau, qui retrouvait son organisation motrice originelle chez un patient amputé qui avait bénéficié d'une greffe de deux mains par l'équipe du professeur Dubernard. Cette plasticité peut être obtenue par simple illusion, comme le montre cette nouvelle étude, actuellement poursuivie auprès de patients amputés.